Teknik ini merupakan teknik paling canggih untuk mendeteksi penyakit (termasuk AIDS), produksi vaksin, identifikasi, serta untuk 1001 kegunaan lain yang belum terkuak sepenuhnya.
BEBERAPA bulan ,yang lalu masyarakat Indo-nesia dihebohkan dengan ditemukannya dua orang WTS di Surabaya yang ternyata mengidap AIDS. Akibatnya pasaran bisnis hiburan syahwat pun sepi untuk sementara waktu. Untuk mendongkrak kelesuan tersebut diberitakan pula bahwa beberapa WTS yang tclah diperiksa darahnya dan hasilnya negatif lalu memasang papan pengumuman “Di sini bebas AIDS” pada pintu prakteknya. Hal ini tentu saja tak dapat dibenarkan karena pada kenyataannya seorang yang tes darahnya negatif bukan berarti ia pasti bebas AIDS.
Sejak virus AIDS masuk ke tubuh, selama beberapa bulan (masa tunas) darah orang tersebut akan negatif pada pemeriksaan serologis. Hal ini dikenal sebagai ‘window period’ atau periode jendela, dalam masa itu virus AIDS sudah ada di dalam tubuh dalam jumlah terbatas tetapi belum cukup untuk
menimbulkan zat anti yang dapat dilacak dengan pemeriksaan serologis. Pada fase ini orang tersebut masih tampak “sehat”, ini diyakini lagi oleh hasil tes serologis darah yang negatif. Tapi pada saat itu sebetulnya ia sudah mengidap virus AIDS dan dapat menularkan virus itu kepada orang lain. Dalam hal ini, kalau saja si WTS yang “bebas AIDS” tadi terus berpraktek, maka dapat dibayangkan berapa banyak orang yang akan tertular virus mematikan ini.
ADVERTISEMENT
SCROLL TO RESUME CONTENT
Pada kasus AIDS dini seperti ini kini telah dapat dideteksi adanya virus AIDS (HIV) dalam darah dengan metode yang dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction yang nama kerennya (disingkat) PCR. Metode ini merupakan suatu cara memperbanyak materi zat inti sel atau Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) secara enzimatis (menggunakan enzim). Caranya, ambil sedikit sampel darah, lalu tambahkan oligonukleotida yang khas DNA virus HIV (atau virus lain yang ingin dideteksi) serta enzim DNA polymerase, maka proses perbanyakan DNA HIV pun bisa dimulai. Adanya satu virus saja sudah cukup untuk dapat menghasilkan hasil positif sehingga diagnosis AIDS dapat dilakukan secara lebih dini. Dengan diagnosis dini seperti ini tentu saja jumlah kasus AIDS akan sangat melonjak tetapi dengan demikian pen-cegahan penularan lebih lanjut pun dapat dilakukan secara dini pula.
PROSES SEDERHANA
Metoda perbanyakan DNA dengan PCR pertama kali ditemukan oleh Kary Mullis yang menggunakannya pertama kali untuk mendiagnosis kelainan genetik yang dikenal sebagai anemia sel sabit (sickle cell anemia). Ketika itu dengan menggunakan enzim DNA polymerase dari fragmen Klenow yang dipanen dari bakteri E. coli ia berhasil memperbanyak fragmen DNA yang mengatur pcnurunan sifat penyakit tadi. Yang dikerjakannya ketika itu hanyalah kcrja yang amat sederhana yaitu mencampurkan DNA, enzim polymerase, dua buah oligonuk-lcotida (primer), bahan DNA (dNTP) lalu menempatkan campuran tersebut berturut-turut pada 3 tempat yang bersuhu tertentu secara berulang-ulang. Setiap kali ia mclakukan satu siklus (3 kali perubahan suhu), DNA yang dimaksud memperbanyak diri sebanyak dua kali lipat. Dcngan dcmikian, jika dilakukan pemindahan sebanyak 20 kali siklus saja maka DNA yang akan diperoleh banyaknya mencapai 2 pangkat 20 atau sama dcngan sejuta kali lipat.
Temuan Kary Mullis ini pada awalnya kurang begitu diminati orang karcna dianggap kurang praktis. Masalahnya enzim polymerase Klenow ini tidak tahan panas, sedangkan proses PCR membutuhkan suhu tinggi. Akibatnya enzim yang hekerja optimal pada suhu 37 dcrajat C ini, perlu terus ditambahkan selama proses berlangsung untuk mengimbangi adanya sejumlah enzim. yang nonaktif pada suhu yang panas tadi.
Kemudian diteniukan enzim polymerase lain yang tahan panas yang diekstraksi dari suatu organisme bernama Thermus aquaticus. Enzim polymerase ini yang dikenal dengan sebutan Taq Polymerase bekerja optimal pada suhu 75 derajat C serta masih stabil sampai suhu 94-95 derajat C. Dengan penemuan enzim ini bukan saja proses PCR dipermudah karena tidak memerlukan penambahan enzim selama proses berlangsung, tetapi hasil perbanyakan DNA nya juga lebih spesifik dalam arti kesalahan dalam perbanyakan DNA menjadi jauh berkurang.
Beberapa waktu yang lalu kembali ditemukan enzim polymerase yang lebih tahan panas dibandingkan Taq polymerase yang dinamakan Vent DNA Polymerase. Enzim ini diisolasi dari Thermococcus litoralis, suatu Archaehacterium yang pat dari lubang pembuangan udara panas pada kapal selam. Polymerase ini bukan saja tahan terhadap suhu 98-100 derajat C, tapi juga menghasilkan produk PCR yang lebih spesifik dibandingkan Taq polymerase.
DNA MATERI KEHIDUPAN
Setiap mahluk hidup memiliki kode genetik yang menyimpan informasi tentang segala aspek kehidupannya, kode itu yang menentukan akan menjadi seperti apa mahluk tersebut. Kode genetik ini yang dikenal sebagai Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) umumnya terdapat di dalam inti sel. DNA terdiri dari susunan gula ribosa, fosfat serta komponen basa Sitosin, Guanin, Timin, dan Adenin. Basa-basa
ini berurutan sedemikian rupa dalam dua buah untaian yang saling melingkar satu Sama lain (disebut susunan ‘double helix’ atau untai ganda). Kedua untai tadi menempel satu sama lain karena setiap basa pada untai yang satu berikatan dengan basa pada untaian lawannya. Ikatan itu sedemikian rupa sehingga basa Sitosin selalu berikatan dengan Guanin dan Adenin dengan Timin. Dengan demikian dikatakan bahwa untai yang satu merupakan komplemen (pasangan) dari untai DNA yang lainnya.
Pada waktu terjadi pembiakan sel (mitosis) di dalam inti sel terjadi perbanyakan DNA secara alamiah. Mula-mula kedua untai DNA terpisah satu sama lain (disebut denaturasi) sehingga membentuk dua buah untai tunggal. Masing-masing untai itu kemudian membentuk komplemennya sendiri-sendiri dengan bantuan enzim perangkai DNA (DNA polymerase). Enzim ini akan rnengikatkan basa-basa komplemen pada setiap basa pada untai tunggal DNA tadi sampai terbentuk sepasang DNA untai ganda kembali. Dengan demikian dari satu DNA kini terbentuk dua DNA dengan separuh bagiannya merupakan DNA bentukan baru yang komplementer terhadap DNA asal.Proses pcmanjangan DNA yang terjadi selalu bermula pada satu ujung tertentu yang dikenal sebagai ujung 5′. Ujung DNA yang berlawanan dengan ujung 5′ dikenal sebagai ujung 3′. Proses ini berulana terus menerus sampai diperoleh cukup banyak DNA. Proses alamiah inilah yang kemudian dicoba ditiru secara laboratoris pada metode PCR.
KOMPONEN PCR
Polymerase Chain Reaction atau PCR pada prinsipnya merupakan suatu metode untuk memperbanyak DNA atau bagian DNA secara enzimatis. Untuk memperbanyaknya digunakan enzim DNA polymerase yang stabil pada suhu tinggi. Pada saat ini enzim polymerase yang paling banyak digunakan adalah Taq polymerase dan Vent polymerase.
Pada suatu reaksi PCR kita mencampurkan 5 komponen dalam satu tabung reaksi dengan total volume
hanya sekitar 50-100 mikroliter. Komponen-komponen tersebut adalah DNA cetakan yang akan diperbanyak (template), Primer, bahan DNA (dNTP), enzim polymerase serta larutan dapar (buffer).
Untuk setiap reaksi PCR kita hanya memerlukan sedikit DNA saja sebagai cetakan. Sebagai contoh , jika yang akan diperbanyak adalah DNA manusia, kita hanya memerlukan 0,1 mikrogram DNA saja sebagai cetakan dan untuk itu satu akar rambut atau setetes darah sudah lebih dari cukup sebagai cetakan. Tentu saja jika kita mempunyai DNA yang lebih banyak, berarti lebih banyak template sehingga akan semakin banyak juga panen DNA yang akan kita peroleh. Pada kenyataannya kita memang menggunakan DNA lebih banyak, sekitar 1-4 ?g DNA untuk sekali reaksi.
Syarat utama untuk melakukan perbanyakan DNA adalah kita harus tahu bagian mana dari DNA yang akan kita perbanyak. Jadi pertama-tama kita harus tahu urutan basa bagian DNA yang dimaksud. Setelah ditentukan bagian yang akan diperbanyak kita membuat patok atau pembatas pada ujung-ujung bagian DNA ini. Pembatas ini, yang kita kenal sebagai Primer, merupakan satu untai DNA rantai pendek (oligonukleotida) yang terdiri dari 15 sampai 20 basa. Urutan basa ini merupakan basa komplemen dari masing-masing ujung fragmen DNA yang akan diperbanyak. Dengan demikian untuk satu reaksi PCR kita akan memerlukan sepasang primer sebagai pembatas. Pada proses perbanyakan DNA, primer akan menempel pada ujung DNA cetakan, lalu primer ini akan diperpanjang dengan penambahan basa-basa lain yang komplementer terhadap basa DNA cetakan sehingga akhirnya kita akan mendapati untaian DNA lengkap kembali sebanyak dua kopi.
Bahan utama untuk membuat DNA adalah nukleotida trifosfat (NTP) yang terdiri dari Adenosin Tri Phos-phat (ATP), Cytosin Tri Phosphat ( CTP ), Guanine Tri Phosphat ( GTP ) serta Thymine Tri Phosphat (TTP). Keempat nukleotida ini secara keseluruhan dikenal sebagai dNTP. Pada proses perbanyakan DNA, primer akan mengalami pemanjangan dengan mengikat basa-basa yang merupakan komplemen dari basa pada DNA cetakan. Jika pada DNA cetakan terdapat basa sitosin maka GTP yang menempel, jika adenin maka TTP yang akan menempel dst.
Selain bahan-bahari utama di atas, untuk kelangsungan reaksi secara optimal diperlukan juga suatu larutan dapar atau buffer. Bahan yang ada dalam buffer bermacam-macam bergantung kepada jenis enzim yang digunakan, namun pada umumnya mengandung kalium, magnesium, Tris dan beberapa bahan kimia lain.
SIKLUS PCR
Satu siklus PCR terdiri dari tiga tahapan yaitu satu urutan pemanasan, pendinginan lalu pemanasan kembali campuran reaksi PCR. Pada pemanasan awal yang dikenal sebagai tahapan DENATURASI, DNA cetakan akan tercerai dari satu untai ganda menjadi dua untai tunggal yang terpisah. Untuk proses ini umumnya dibutuhkan pemanasan antara 94-96 derajat C selama beberapa puluh detik. Tahap kedua adalah pendinginan sampai suhu 30-50 derajat C selama beberapa puluh detik. Tahap yang disebut tahap ANNEALING (penempelan) ini merupakan tahap primer menempel pada ujung 5′ pada bagian DNA yang akan diperbanyak. Primer ini dapat menempel karena ia telah dibuat khusus sehingga urutan basanya merupakan urutan basa komplemen dari DNA pada ujung bagian yang akan diperbanyak .
Setelah tahap penempelan ini berlangsung, maka primer perlu diperpanjang agar, dapat terbentuk DNA untai ganda yang lengkap. Fase ketiga ini dikenal sebagai fase EXTENSION (fase pemanjangan) dan terjadi pada suhu tinggi yaitu sekitar 72 derajat C. Proses ini memerlukan waktu beberapa menit.
Untuk dapat mengetahui apakah reaksi PCR yang kita lakukan telah berhasil memperbanyak DNA atau tidak, maka kita menampilkan DNA hasil proses PCR pada bahan agar dan melakukan elektroforesis pemisahan dalam medan listrik). Dengan menambahkan zat warna ethidium bromide maka produk PCR dapat kita amati di bawah cahaya ultraviolet. Proses PCR kita dikatakan berlangsung baik jika pada agar kita dapati adanya pita atau bintik DNA .
HEMAT WAKTU
Untuk satu siklus PCR umumnya kita hanya memerlukan waktu antara 2 sampai 5 menit saja dan dalam waktu tersebut DNA akan berlipat dua kali jumlahnya. Untuk mendapatkan hasil DNA yang cukup banyak maka siklus ini diulang beberapa puluh kali. Secara teoritis jika kita melakukan sejumlah n siklus PCR kita akan mendapatkan perbanyakan DNA sebanyak 2 pangkat n kali lipat. Walaupun demikian tidak-lah dianjurkan melakukan perbanyakan lebih dari 30 atau 40 kali siklus karena di atas angka ini terjadi apa yang dinamakan efek pendataran (plateau). Pada efek ini penambahan siklus PCR tidak akan lagi menghasilkan jumlah DNA seefektif semula karena bahan-bahan pada reaksi telah hampir habis. Jika misalnya kita ingin memper-banyak DNA sebanyak sejuta kali maka kita cukup melakukan 20 siklus PCR yang hanya memakan waktu 20 x 5 menit atau 100 menit saja. Dengan demikian dapat kita bayangkan betapa cepatnya kerja metode ini.
Saat ini dengan adanya alat yang semi otomatis maka seluruh proses menjadi lebih mudah. Proses PCR akan berjalan sendiri setelah kita memprogram parameter suhu serta waktu ke dalam alat tersebut, menentukan banyak siklus dan memasukkan campuran reaksi PCR. Setelah proses dijalankan kita tinggal menunggu sampai seluruh proses selesai. Sayangnya alat yang dinamakan Thermal Cycler, Thermal Controller atau PCR machine ini masih mahal harganya, berkisar antara 10 sampai 25 juta rupiah.
Walaupun demikian tidak adanya alat bukan merupakan halangan untuk melakukan PCR karena kita dapat melakukan prosedur seperti Kari Mullis. Untuk itu kita cukup menyiapkan 3 buah in-kubator air (waterbath) dengan tiga suhu yang berbeda. Kita tinggal memindah-mindahkan tabung reaksi dari satu waterbath ke waterbath lainnya secara berurutan. Jumlah pemindahannya silahkan hitung sendiri: yaitu sebanyak 3 kali jumlah siklus yang kita tentukan. Jadi lumayan juga tenaga yang mesti dikeluarkan untuk itu.
KEGUNAAN LAIN
Sejak ditemukannya metode PCR yang dilanjutkan dengan penemuan Taq Polymerase yang thermostabil, suatu revolusi di bidang bioteknologi telah terjadi. Berturut-turut para peneliti di berbagai belahan dunia melaporkan kegunaan PCR dalam ber-bagai bidang. Dalam bidang kedokteran, selain untuk mendeteksi virus AIDS pada penyakit AIDS yang dini, tehnik PCR juga dilaporkan berguna untuk mendeteksi berbagai penyakit lain seperti penyakit malaria, TBC, meningitis, penyakit virus, penyakit autoimun, penyakit genetik serta untuk mendeteksi adanya gen pembawa kanker (onkogen).
Pada penyakit infeksi, proses PCR dilakukan terutama jika kuman, virus atau parasitnya berjumlah sangat sedikit sehingga sulit dideteksi dengan cara biasa. Dengan PCR maka DNA kuman, virus atau parasit ini akan diperbanyak sehingga dapat diketahui ada atau tidaknya. Sedangkan pada pemeriksaan penyakit genetik (keturunan) serta pencarian adanya onkogen proses PCR dilakukan untuk memperbanyak gen tersebut. Jika gennya memang ada, maka setelah proses PCR akan tampak adanya produk PCR pada agar hasil elektroforesis. Pemeriksaan ini dilakukan misalnya untuk mendeteksi adanya gen penyebab penyakit talasemia, penyakit fenilketonuria (PKU), fibrosis kistik dan sebagainya pada si pembawa (carrier) penyakit. Jika didapatkan gen demikian pada kedua pasangan yang ingin menikah, maka besarnya risiko untuk mendapatkan anak yang menderita penyakit ini (walaupun kedua orangtuanya tampak “normal”) tentu perlu diberitahukan pada pasangan tersebut. Data hasil PCR ini bermanfaat terutama untuk bahan pertimbangan oleh pasangan tersebut sebelum mereka memutuskan untuk mempunyai anak.
Dalam bidang penelitian metode PCR sangat berguna untuk mendeteksi adanya suatu mutasi pada DNA serta untuk pembuatan vaksin. Dengan melokalisir gen-gen pembentuk antigen lalu memperbanyaknya kita akan mendapatkan cukup antigen yang merupakan bahan untuk membuat vaksin. Saat ini dengan adanya tehnik tertentu untuk menggabungkan fragmen DNA satu dengan yang lainnya maka dimungkinkan untuk membuat vaksin yang mengandung sekaligus beberapa antigen. Tehnik ini sekarang telah mulai digunakan untuk pembuatan beberapa vaksin, di antaranya adalah vaksin AIDS dan malaria.
Dalam bidang kedokteran forensik metode PCR sangat berguna untuk melakukan identifikasi korban atau pelaku kejahatan, karena bahan yang diperoleh berupa rambut, darah, jaringan, sperma, dan lain-lain biasanya amat sedikit jumlahnya sehingga seringkali tak dapat dideteksi dengan cara biasa. Kemampuan PCR untuk memperbanyak DNA dari sampel yang tidak segar lagi juga merupakan keuntungan, karena bahan pada kasus forensik umumnya sudah tidak segar lagi. ‘PCR membantu memperbanyak DNA ini sehingga cukup banyak untuk dapat dianalisis lebih lanjut, misalnya untuk digunakan pada pemeriksaan sidik DNA.
Pada kasus penganiayaan dengan korban sempat mencakar pelakunya, dengan mengambil kerokan bagian dalam kuku korban akan didapat sejumlah sel kulit pelaku berikut DNA-nya. Dengan memperbanyak DNA-nya itu lalu dilakukan proses sidik DNA (DNA fingerprinting) maka akan dapat dilacak siapa pelakunya. Dalam pelacakan pelaku perkosaan yang hanya meninggalkan sedikit bercak sperma, kasus tabrak lari serta pembunuhan yang meninggalkan sedikit benda bukti berupa darah, rambut atau jaringan maka PCR akan membantu memperbanyaknya sehingga dapat dianalisis lebih lanjut. Ini tentu bukan berita yang baik bagi para pelaku tindak kriminal.
KENDALA
Salah satu kendala yang masih dirasakan pada metode PCR ini adalah terutama masalah kontaminasi. Proses perbanyakan DNA yang dilakukan dengan begitu hebat tentu juga akan memperbanyak DNA kontaminan. Jika ini sampai terjadi kacaulah semuanya. Atas dasar itulah maka segala prosedur harus dila-kukan secara ekstra hati- hati dan bersih. Bahan-bahan seperti pipet, tabung reaksi haruslah yang sekali pakai langsung dibuang. Dan pemeriksa harus selalu mengenakan jas laboratorium dan sarung tangan selama proses persiapan reaksi PCR.
Kendala lain yang dirasakan adalah masih mahalnya alat serta bahan untuk metode ini. Enzim polymerase yang digunakan harganya bisa mencapai setengah jutaan rupiah per mililiter, walaupun penggunaannya hanya beberapa mikroliter saja untuk sekali pakai.
Terlepas dari segala kendala diatas agaknya metode ini memang sudah saatnya kita kenal dan manfaatkan untuk berbagai usaha peningkatan kesehatan dan kesejahteraan umat manusia. Karena bagaimanapun hebatnya suatu tehnologi tanpa dimanfaatkan ia tak lebih dari seonggok sampah belaka.
Oleh: dr. DJAJA SURYA ATMADJA
Sumber: Majalah AKU TAHU/ MARET 1992
